（1    *南京蛋生生物科技研究院，南京211800；）（2.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海 200082；）

摘要：本實驗研究了雞蛋清水解物（HEpep）對斑馬魚的疲勞改善作用。將斑馬魚隨機分為6組，分別為空白對照組（養育用水處理）、疲勞模型對照組、中華跌打丸組以及3個HEpep濃度組。28℃培養箱中培養一段時間后，除空白對照組外，其余組均同時水溶給予亞硫酸鈉以誘發斑馬魚疲勞模型，然后水溶給予中華跌打丸(1 mg/mL)處理陽性對照組，分別以水溶給予111, 333和1000 μg/mL濃度的HEpep處理HEpep劑量組。養魚一段時間后，利用行為分析儀測定斑馬魚的運動總距離，并用凝膠滲透色譜測定了HEpep的分子量以及氨基酸含量。結果顯示：HEpep分子量668以及303的肽段占比最大，分別占25%以及48%；必需氨基酸占氨基酸總量接近36%，必需氨基酸與非必需氨基酸比例為0.56；支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸）含量豐富，高達15.93 mg/g。與疲勞模型對照組比較，中華跌打丸組運動改善作用為115.2%； 在 111、333和1000 μg/mL濃度的濃度條件下，其運動改善作用分別為72.5%、16.9% 和1.9%，乳酸含量分別降低63.2%、18.8%和5.1%。該結果表明，HEpep對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用，可以顯著性降低斑馬魚體內乳酸含量。HEpep作為疲勞改善劑使用時，推薦適宜濃度范圍為 0–111 μg/mL。

關鍵詞：雞蛋清水解物；氨基酸；斑馬魚；疲勞

Improvement of Egg White Hydroysate on Fatigue

Zebrafish Induced by Sodium Sulfite

WANG Yu^1*, LIU Caiyun²

(1^*.Nanjing Egg Biotechnology Research Institute, Nanjing 211800, China) (2.School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;)

Abstract: Effect of egg white hydroysate (HEpep) on fatigue zebrafish induced by sodium sulfite was investigated. Zebrafish were randomly divided into six groups: blank group, fatigue model group, Zhonghua Dieda pill group and three concentrations of HEpep group. After incubation at 28℃, except for the blank group, all the other groups were treated by sodium sulfite to induce zebrafish fatigue model. Then Zhonghua Dieda pill at a dose of 1 mg/mL, and HEpep at doses of 111, 333 and 1000 μg/mL was used to treat the fatigue zebrafish respectively. After incubation, the total movement distance of zebrafish was measured by behavior analyzer. The molecular weight and amino acid content of HEpep were also measured. Results showed that molecular weight of 668 and 303 in HEpep accounted for the largest, 25% and 48% respectively; The proportion of essential amino acids to total amino acids was close to 36%, the proportion of essential amino acids to non-essential amino acids was 0.56, branched chain amino acids (Leu + Ile + Val) were rich in HEpep, up to 15.93 mg/g. The total movement distance of zebrafish in Zhonghua Dieda pill group was 115.2% of improvement compared with the model group; In the group treated by HEpep at doses of 111, 333 and 1000 μg/mL, the improvement rate of movement distance was 72.5%, 16.9% and 1.9% respectively, the decrease rate of lactic acids content was 63.2%、18.8% and 5.1% respectively. The results indicated that HEpep could significantly improve the exercise ability and decrease lactic acid content of fatigue zebrafish induced by sodium sulfite. The optimum concentration of HEpep is 0 – 111 μg/mL when it’s used as a fatigue improver. 

Key words: egg white hydrolysate; amino acid;zebrafish; fatigue

通訊作者：王玉，1990年生，女，博士研究生，研究方向：雞蛋生物功能性開發、特醫食品研究與開發。

疲勞是持久或過度勞累后造成的身體不適及工作效率減退的現象^[1]。長期以來眾多學者期望能尋找到一種安全、有效、無毒副作用的方法來有效的延緩疲勞的發生和加速疲勞的消除^[2]。

雞蛋清蛋白質氨基酸模式與人體的最接近，生物利用率高，被認為是蛋白質的理想來源。蛋清蛋白經過一種或多種酶水解后形成具有生物活性的肽段，可在食品工業和醫藥行業方面發揮極大作用^[3,4]。目前發現的雞蛋中的生物活性肽包括降血壓肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫調節肽以及促進腦部健康肽等^[5-9]。

斑馬魚是一種新型模式脊椎動物，具有繁殖能力強、生殖周期短、胚胎透明、能在顯微鏡下進行實時觀察等特點。其基因與人類基因有著87%的相似性，它們的編碼蛋白結構相似而且在生物體內發揮類似的功能、被美國食品藥品監督管理局列為繼人和嚙齒類鼠之后的第三大模式生物，已廣泛應用于生命科學研究^[10-11]。

本研究利用行為分析儀測定斑馬魚的運動總距離，以統計學意義確定了HEpep對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動的改善作用, 旨在探索雞蛋清水解物的新的應用方向。

1  材料與方法 

1.1  原料 

斑馬魚（品種：野生AB系）；HEpep（厚德食品股份有限公司）；亞硫酸鈉、NaOH溶液、檸檬酸（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；中華跌打丸（廣西梧州制藥（集團）股份有限公司）;乳酸測定試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.2  主要儀器設備 

V3行為分析儀 ViewPoint Life Sciences；SPX-250B-Z生化培養箱 博迅實業；Waters 1525高效液相色譜儀；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；

1.3  試驗方法    

1.3.1 HEpep的制備工藝

HEpep制備工藝：蛋清蛋白→酶解→酶解液→膜分離→濃縮噴霧干燥→蛋清蛋白肽。

1.3.2 HEpep分子量大小的測定

HEpep分子量大小的測定采用Waters 1525高效液相色譜儀（配2487紫外檢測器和Empower工作站GPC軟件），色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm、流動相為乙腈/水/三氟乙酸= 45/55/0.1（V/V/V）、檢測波長為220 nm、流速為0.5 ml/min、柱溫為 30℃。

1.3.3 HEpep氨基酸含量的測定

氨基酸含量：用日立L-8900全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.4 斑馬魚仔魚的準備

斑馬魚均飼養于28℃的養魚用水中（水質：每1L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為 480~510 μS/cm；pH為6.9~7.2；硬度為53.7~71.6 mg/L CaCO₃），實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。飼養管理符合國際AAALAC認證的要求。

野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后4天（4 dpf），共180尾，每實驗組為30尾，用于確定HEpep抗疲勞作用的最大檢測濃度（MTC）。野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后4天（4 dpf），共180尾，每實驗組為30尾，用于HEpep抗疲勞作用評價。

1.3.5 確定HEpep的最大檢測濃度（MTC）

隨機選取180尾受精后4天（4 dpf）野生型AB品系斑馬魚，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，分別水溶給予HEpep 250、500、1000、2000和4000 μg/mL濃度，同時設置正常對照組（即養魚用水處理斑馬魚），每孔（實驗組）容量為5 mL，置于28℃培養箱中培養1天至5 dpf。實驗結束后，觀察記錄斑馬魚的死亡數量和毒性情況，確定HEpep對斑馬魚的最大檢測濃度（MTC）。

1.3.6 HEpep對斑馬魚運動的影響

隨機選取180尾受精后4天（4 dpf）野生型AB品系斑馬魚，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，分別水溶給予HEpep 111、333和1000 μg/mL濃度，陽性對照藥中華跌打丸1 mg/mL濃度，同時設置正常對照組（即養魚用水處理斑馬魚）和模型對照組，每孔（實驗組）容量為5 mL。28℃培養箱中培養1天至5dpf后，除正常對照組外，其余實驗組均用8 mg/mL亞硫酸鈉處理5 dpf斑馬魚20 min，以誘發斑馬魚疲勞模型。

HEpep和亞硫酸鈉共同處理斑馬魚20 min后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚，利用行為分析儀，測定斑馬魚的運動總距離（S），以統計學意義評價HEpep對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動的改善作用。

HEpep對斑馬魚運動能力改善作用計算公式如下：

運動能力改善作用（%）=（S－S_M）/( S_C－S_M)*100%

S：供試品組；S_M：模型對照組；S_C：正常對照組

1.3.7 運動后斑馬魚乳酸含量測定^[12]

用乳酸測試盒按步驟加樣后可見光分光光度計測其吸光值（波長530 nm）， 制作乳酸含量的標準曲線。在低溫環境中，將運動后的模型斑馬魚、陽性對照組（用中華跌打丸處理）以及HEpep 3個濃度（111, 333和1000 μg/mL）處理后的斑馬魚用10倍生理鹽水制成勻漿液，離心后取上清液稀釋5倍后測其吸光值（波長530 nm），通過標準曲線計算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度(mmol/ L)，換算后即得斑馬魚體內乳酸濃度。

乳酸含量減少率（%）=（模型斑馬魚乳酸濃度-處理后斑馬魚）/模型斑馬魚乳酸濃度*100%。

1.3.8數據處理

用方差分析和Dunnett’s T-檢驗進行統計學分析，p < 0.05表明具有顯著性差異。

2  結果與討論

2.1      HEpep的分子量

雞蛋清水解物HEpep的分子量檢測結果如圖1所示。從表1中可知，分子量為668以及303的肽段占比最大，分別占25%以及48%。

圖 1 HEpep的凝膠滲透色譜圖  

Fig.1 Analytical results of HEpep by GPC chromatopgraphy.

表 1 HEpep的凝膠滲透色譜分析結果

Table 1 Analytical results of HEpep by GPC chromatopgraphy

2.2 HEpep的氨基酸含量檢測結果

本研究對雞蛋清水解物HEpep的氨基酸含量進行了分析，結果如表2所示?？梢钥闯?，HEpep中必需氨基酸占氨基酸總量的36%，而且必需氨基酸是非必需氨基酸的0.56倍。根據FAO/WHO，理想蛋白模式中，必需氨基酸應該占氨基酸總量的40%左右，且必需氨基酸應是非必需氨基酸的0.60倍。由此可以得出HEpep的氨基酸模式非常接近FAO/WHO對理想蛋白質的規定，而且HEpep中氨基酸含量高達127.68 mg/g，說明HEpep可以作為一種理想的蛋白質來源。另外，HEpep中支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸）的含量高達15.93 mg/g。

表 2 HEpep的氨基酸含量檢測結果

Table 2 Amino Acid Composition of HEpep

*表示人體必需氨基酸

2.3 HEpep濃度對斑馬魚死亡率的影響

表3表明了HEpep處理后斑馬魚“濃度-死亡率”的實驗結果，由表3可知HEpep在250至1000 μg/mL濃度下，未引起斑馬魚死亡，也未見其他明顯的毒性表型；然而在2000和4000 μg/mL濃度下，分別誘發11/30和30/30尾斑馬魚死亡，死亡率分別為36.7%和100%，故確定HEpep對斑馬魚抗疲勞作用的最大檢測濃度為1000 μg/mL，因此抗疲勞作用正式實驗濃度設置為111、333和1000 μg/mL。

表 3 HEpep 處理后斑馬魚“濃度-死亡率”實驗結果（n=30）

Table 3 “Concentration- death rate ” result of zebrafish treated by HEpep（n=30）

2.4 HEpep的抗疲勞作用評價

亞硫酸鈉可以與水中的溶解氧發生反應，造成環境中缺氧，斑馬魚在缺氧環境中造成疲勞，因此常用于疲勞造模^[13]。運動耐力實驗是反映機體疲勞最直接、最客觀的指標，是機體運動過程中物質代謝和能量代謝的綜合體現^[14]。

陽性對照藥中華跌打丸由金不換、半邊蓮等數十種中草藥組成, 具有消腫止痛、舒筋活絡、止血生肌、活血驅風的功效^[15]。從表4中可知，模型對照組斑馬魚總運動距離（2622 mm）與正常對照組（6505 mm）比較，說明疲勞斑馬魚模型構建成功；陽性對照藥中華跌打丸組（1 mg/mL）斑馬魚總運動距離為7097 mm，與模型對照組比較其運動改善作用為115.2%。根據圖2所示，中華跌打丸組斑馬魚運動后體內乳酸含量最低（0.003 mmol/g），與模型對照組比較（乳酸含量 0.092 mmol/g），乳酸含量降低 97%，說明中華跌打丸可顯著改善亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力, 降低體內乳酸含量。此結果與高華等人的研究結果一致：中華跌打丸能明顯延長小鼠負重游泳時間, 降低運動后血清尿素氮的含量, 加快運動后血清乳酸的消除速率, 對緩解機體運動中的疲勞感有積極的作用^[16]。

HEpep 111、333和1000 μg/mL濃度組斑馬魚總運動距離分別為5439、3280和2697 mm，與模型對照組（2622 mm）比較，其運動改善作用分別為72.5%、16.9%和1.9%， HEpep處理后斑馬魚運動后體內乳酸含量分別為0.034，0.075 和0.087 mmol/g（圖2），與模型對照組比較，乳酸含量分別降低63.2%、18.8% 和 5.1%。說明在本實驗濃度條件下，HEpep對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用，而且當HEpep濃度為111μg/mL時，該作用最明顯，乳酸含量降低率也最大。當HEpep濃度大于111 μg/mL時（333和1000 μg/m），對疲勞斑馬魚運動改善作用呈現減弱趨勢，運動后斑馬魚體內乳酸累積量也呈現上升趨勢。該結果提示 HEpep作為疲勞改善劑使用時，適宜濃度范圍為 0 - 111 μg/mL，并非劑量越大越好。根據HEpep的GPC分子量分析結果顯示，分子量668以及303的肽段占比最大，分別占25%以及48%。研究發現，小分子肽在人體不需消化可直接吸收，能直接參與蛋白質的合成^[17]。蛋清蛋白通過酶解作用也可產生具備抗氧化活性的氨基酸，包括半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸等^[18]，可清除體內超氧陰離子和羥基自由基（·OH），維持機體氧化還原平衡^[19]，降低疲勞感。根據表2結果，HEpep中具有抗疲勞功效的支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸）含量高達15.93 mg/g，可能是HEpep對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用的原因。

表 4 HEpep 對疲勞斑馬魚運動能力的影響（n=10）

Table 4 Effect of HEpep on exercise ability of fatigue zebrafish（n=10）

與模型對照組比較：***p < 0.001

圖 2 HEpep 對疲勞斑馬魚體內乳酸含量的影響 (p < 0.05)（n=10）

Fig.2 Effect of HEpep on lactic acid content in fatigue zebrafish (p < 0.05)（n=10）

3  結論

在本研究中，雞蛋清水解物HEpep中支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸）含量豐富，高達15.93 mg/g。對于亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚，在111、333和1000 μg/mL的濃度條件下，其運動改善作用分別為72.5%、16.9%和1.9%，乳酸含量分別降低63.2%、18.8%和5.1%。HEpep對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用，HEpep作為疲勞改善劑使用時，適宜濃度范圍為 0 - 111 μg/mL。

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